Lorsqu'un échantillon est mélangé avec le R1 et le R2, la créatinine présente dans l'échantillon est convertie en créatine par l'action de créatininase.

La créatine formée est hydrolysée par la créatinase pour produire de la sarcosine et de l'urée.

La sarcosine produite est ensuite décomposée par l'oxydase de sarcosine pour former de la glycine, des formaldéhydes et du peroxyde d'hydrogène. En présence de peroxydase (POD), le peroxyde d'hydrogène formé donne un pigment bleu par condensation d'oxydation quantitative avec la N-(3-sulfopropyle)-3-méthoxy-5-méthylaniline (HMMPS) et 4-aminoantipyrine (4-AA). 

La concentration de la créatinine est obtenue en mesurant l'absorbance de la couleur bleue.