En milieu acide (pH 4.8), le fer sérique est libéré instantanément de la transferrine et réduit en fer ferreux (Fe++).

Le fer férène S forme avec le fer ferreux un complexe  coloré stable. L’intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité en fer de l’échantillon.

La présence d’un agent spécifique supprime l’interférence du cuivre.