Basé sur la dégradation du fructose-1,6-biphosphate en glycéraldéhyde-3-phosphate (GAP) et dihydroxyacétone phosphate (DAP) par l'aldolase. Le GAP se transforme en DAP grâce à l'action du TIM.

Le DAP réagit ensuite avec du NADH et des ions H+ pour donner du NAD+ dont la longueur d'onde est de 340, Hg 334 et Hg 365 nm.